Что представляет собой метод спектрофотометрического определения витамина А?
Метод спектрофотометрического определения витамина А рекомендован Международным союзом теоретической и прикладной химии в 1956 г. и принят большинством фармакопеи. Ниже мы рассматриваем способ, описанный во Втором издании Международной фармакопеи.
Метод. Все процедуры должны проводиться быстро, насколько это возможно, следует принимать меры во избежание воздействия света и окислительных агентов.
Так как положение максимума поглощения является важным критерием и поправочные уравнения требуют измерений при точных длинах волн, необходимо, чтобы шкала длин волн спектрофотометра была проверена немедленно перед определением. Ртутные линии при 313,16 и 334,15 нм являются подходящими точками и для удобства настройка прибора по этим линиям может быть связана о. его настройкой по водородным линиям при 379,7 и 486,1 нм. Точность исправленного поглощения значительно ниже, чем три непосредственно измеренных поглощения, из которых оно рассчитывается; следовательно, измерения требуют особой осторожности и следует проводить не менее двух количественных определений.
Витамин А в форме эфира. Образец, нерастворимый непосредственно в циклогексане, может быть обработан экстракцией или другими средствами, не связанными с омылением. Если это невозможно, поступают так, как описано в разделе «Другие формы витамина А».
Растворяют точно взвешенное количество образца или приготовленного извлечения в достаточном количестве циклогексана для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в миллилитрах. Определяют длину волны максимума поглощения. Измеряют поглощения при длинах волн, приведенных в табл. 14, и рассчитывают их как отношение к поглощению при 328 нм.
Рассчитывают также поглощение при 328 нм в виде Е(1%, 1 см) или в виде «а» -поглощаемость.
Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм и наблюдаемые относительные поглощения находятся в пределах 0,02 от указанных в таблице, определяют активность образца в Международных единицах и в граммах по формуле:
Е(1%, 1 см)328-1900.
Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм, но относительные поглощения не находятся в пределах 0,02 от указанных в табл. 14, рассчитывают исправленное
|
Длина волны (в нм) |
Относительное поглощение |
|
300 |
0,555 |
|
316 |
0,907 |
|
328 |
1,000 |
|
340 |
0,811 |
|
360 |
0,299 |
|
|
|
Таблица 14
поглощение при 328 нм, применяя найденные показания в уравнении:
А328 (испр.) = 3,52 (2A52S - А310 - А340).
Если исправленное поглощение лежит в пределах -15% или +3% неисправленного поглощения, активность рассчитывают по исправленному поглощению.
Если исправленное поглощение лежит вне -15% или + 3% неисправленного поглощения или максимум поглощения не приходится на область 326 и 329 нм, образец подвергают анализу, как это описано в разделе «Другие формы витамина А».
Другие формы витамина А. Смешивают точно взвешенное количество образца, содержащего не менее 500 Международных единиц витамина А и не более 1 г жира с 30 мл безводного спирта и 3 мл 50% раствора едкого кали, кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут, под током азота, свободного от кислорода, быстро охлаждают и прибавляют 30 мл воды. Переносят гидролизат в делительную воронку с помощью трех количеств, каждое 50 мл, эфира и извлекают витамин А встряхиванием в течение ми-путы. После полного разделения слоев отбрасывают водный слой и промывают извлечение четырьмя порциями, каждая 50 мл, воды смешивая осторожно во избежание образования эмульсии во время первых двух промываний. Упаривают определенный экстракт до 5 мл и удаляют оставшийся растворитель в токе азота, свободного от кислорода, без применения нагревания. Растворяют остаток в достаточном количестве изопропилового спирта для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в 1 миллилитре и измеряют поглощения при 300, 310, 325 и 334 нм. Определяют длину волны максимума поглощения.
Если максимум поглощения лежит между 323 и 327 нм и отношение поглощения при 300 нм к поглощению при 325 нм не превышает 0,73, получают исправленное поглощение по уравнению:
А325 (испр.) =6,815 А325-2,555 А310-4,260 А394.
Активность образца в Международных единицах в граммах рассчитывают по формуле:
Е325 (испр.) х 18 300,
за исключением случая, когда исправленное поглощение лежит в пределах ±3,0% неисправленного поглощения, исправленным поглощением можно пренебречь, и активность рассчитывают по неисправленному поглощению.
Если максимум поглощения лежит вне области 323 до 327 им или отношение поглощения при 300 нм к поглощению при 325 нм превышает 0,73, неомыленную часть образца нужно подвергать хроматографированию.
При выполнении спектрофотометрического анализа витамина А следует принимать во внимание, что растворы ретинола исключительно чувствительны по отношению к свету.
В качестве растворителей применяются петролейный эфир, циклогексан, изопропиловый спирт и реже хлороформ. Чаще всего предпочитают циклогексан, так как спектральные различия в области 310 до 315 нм между нео- и транс-витамином А менее проявляются в этом растворителе. Растворители подвергают дополнительной очистке путем перегонки; рекомендуется также проверять их спектральную чистоту в области от 300 до 350 нм.
Согласно ГФХ, содержание ретинола определяют в индивидуальном веществе спектрофотометрически при 326 ям в растворе в абсолютном спирте. Предварительно проводят испытание на поглощающие примеси. Расчет производят принимая 1550 за величину Е (1%, 1 см) для 100% ретинола при длине волны 326 нм.
Фармакопея США XVII указывает, что при условиях определения (поглощение измеряют после омыления) следует ожидать расхождения в данных, полученных различными лабораториями при Р = 0,05 около ±8%.
26.05.2015