703. Trypsinum crystallisatum

Трипсин кристаллический

Трипсин кристаллический получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота в виде кристаллов с последующей лиофилизацией.

Описание. Пористая масса или порошок белого или белого со слегка желтоватым оттенком цвета, без запаха.

Растворимость. Легко растворим в воде и изотоническом 0,9% растворе хлорида натрия.

Подлинность. 3 мг препарата (точная навеска) растворяют в 12 мл 0,1 н. ацетатного буфера (рН 5,6). В 3 пробирки помещают по 3 мл раствора обезжиренного сухого молока, в 2 из них добавляют по 0,5 мл полученного раствора препарата, а в третью - контрольную - 0,5 мл ацетатного буфера. Содержимое пробирок взбалтывают, пробирки помещают в термостат с температурой 35^е на 10 минут. Молоко не должно свертываться (отличие от химотрипсина).

Примечание. 1. Приготовление раствора обезжиренного сухого молока. Свежее натуральное коровье молоко центрифугируют 30 минут при 7000-8000 об/мин, удаляют жир и лиофильно высушивают. Хранят в темном прохладном месте. Полученное обезжиренное сухое молоко пригодно к употреблению в течение 6 месяцев.

0,75 г обезжиренного сухого молока растирают в ступке с небольшим количеством воды. Растертую массу количественно переносят в цилиндр емкостью 50 мл, добавляют 1 мл 3 мол раствора хлорида кальция и 5 мл 1 н. ацетатного буфера (рН 5,6), доводят объем раствора водой до 50 мл и перемешивают. Раствор обезжиренного сухого молока готовят непосредственно перед проведением анализа.

2. Приготовление 1 н. ацетатного буфера. 5,8 мл уксусной кислоты разводят водой до 100 мл. 13,6 г ацетата натрия растворяют в 100 мл воды. Смешивают полученные растворы в соотношении 5,5 : 44,5, рН смеси 5,6.

Прозрачность и цветность раствора. Раствор 0,01 г препарата в 5 мл воды должен быть прозрачным или со слабой опалесценцией и бесцветным.

Кислотность. рН 3,0-5,5 (0,2% водный раствор, потенциометрически).

Сульфаты. При добавлении к 1 мл 0,2% раствора препарата нескольких капель 10% раствора хлорида бария раствор должен оставаться прозрачным.

Потеря в весе при высушивании. Около 0,2 г препарата (точная навеска) сушат при 100-105° до постоянного веса. Потеря в весе не должна превышать 8%.

Испытание на токсичность. Тест-доза 0,25 мг препарата в 0,5 мл изотонического 0,9% раствора хлорида натрия, внутримышечно. Срок наблюдения 24 часа (стр. 952).

Испытание на пирогенность. Раствор препарата в концентрации 0,1 мг)мл в изотоническом 0,9% растворе хлорида натрия вводят внутримышечно в количестве 1 мл на 1 кг веса животного (стр. 953).

Испытание на стерильность. Препарат должен быть стерильным (стр. 955).

Количественное определение. Протеолитическая активность. Метод основан на определении количества тирозина, освобождаемого трипсином из гемоглобина в определенных условиях. Протеолитическая активность выражается в тирозиновых единицах (ТЕ^HB_35,5° ) по Ансону.

Препарат имеет активность в 1 тирозиновую единицу, если при воздействии его на субстрат в течение одной минуты освобождается такое количество продуктов гидролиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, которое при реакции с фенольным реактивом соответствует 1 миллиэквиваленту (мэкв) тирозина.

2,5 мг препарата (точная навеска) растворяют в 200 мл 0,0025 н. раствора соляной кислоты. В контрольную и 2 опытные пробирки вносят по 5 мл субстрата. В контрольную пробирку добавляют 10 мл 0,3 н. раствора трихлоруксусной кислоты, 1 мл приготовленного раствора препарата и тщательно перемешивают. Опытные пробирки и раствор препарата нагревают в водяной бане при 35,5±0,5° в течение 3 минут. К содержимому пробирок добавляют по 1 мл подогретого раствора препарата, тщательно перемешивают и выдерживают в термостате при той же температуре в течение 10 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 10 мл 0,3 н. раствора трихлоруксусной кислоты. После осаждения белков смесь выдерживают при комнатной температуре 30 минут. Содержимое контрольной и опытных пробирок фильтруют через плотную фильтровальную бумагу. В конические колбы емкостью 25 мл вносят по 5 мл фильтрата, по 10 мл 0,5 н. раствора едкого натра и затем, при помешивании, по 3 мл рабочего раствора фенольного реактива. Через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлек-троколориметре ФЭК-М с красным светофильтром в кювете с толщиной слоя 1 см.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график строят по стандартному раствору тирозина (ТУ 723-61). Навеску тирозина рассчитывают по содержанию азота. В 100 мг тирозина (точная навеска) определяют содержание азота (стр. 762) и находят содержание тирозина в 1 мг препарата.

Навеску, соответствующую 14,495 мг чистого тирозина, растворяют в 100 мл 0,2 н. раствора соляной кислоты. Полученный раствор содержит 8•10^-4 мэкв тирозина в 1 мл. Для получения стандартного раствора 10 мл переносят в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят объем раствора 0,2 н. раствором соляной кислоты до метки. 5 мл полученного раствора содержат 0,0008 мэкв (8 • 10^-4 мэкв) тирозина.

Для построения калибровочного графика готовят следующие разведения стандартного раствора:

Стандартный раствор	0,2 н. раствор	Содержание тирозина,
тирозина, мл	соляной кислоты, мл	мэкв X 10*
5,00	0	8,0
4,00	1,00	6,4
3,00	2,00	4,8
2,00	3,00	3,2
1,75	3,25	2,8
1,50	3,50	2,4
1,20	3,80	1,92
1,00	4,00	1,6
0,50	4,50	0,8
0,25	4,75	0,4
Контрольный	5,00	Контрольный
опыт		опыт

После этого к содержимому каждой пробирки добавляют по 10 мл 0,5 н. раствора едкого натра и по 3 мл рабочего раствора фенольного реактива. Через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре ФЭК-М с красным светофильтром в кювете с толщиной слоя 1 см, сравнивая с контрольным опытом. Затем строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество тирозина в миллиэквивалентах, умноженных на 10⁴, в пробе, а по оси ординат соответствующие оптические плотности.

Из величины оптической плотности опытных растворов вычитают величину оптической плотности контрольного раствора и по найденной оптической плотности и калибровочному графику находят содержание тирозина в миллиэквивалентах, умноженных на 10⁴, в опытных пробах.

Количество тирозиновых единиц в 1 г препарата (X) вычисляют по формуле:

X = (a*10^-4*б*16*1000) / (в*1*5*10)

где а - содержание тирозина в опытной пробе в миллиэквивалентах, умноженных на 10⁴ (среднее из двух определений); б - объем, в котором растворен препарат, в миллилитрах; в - навеска препарата в миллиграммах. 1 г препарата должен содержать не менее 8 тирозиновых единиц.

Примечание. 1. Гемоглобин. Дефибринированную кровь крупного рогатого скота центрифугируют и сыворотку удаляют сифоном. Осадок эритроцитов суспендируют в равном объеме охлажденного 1 % раствора хлорида натрия, центрифугируют и надосадочную жидкость удаляют сифоном. Эритроциты диализуют против водопроводной воды в течение 24 часов. Хранят гемоглобин либо в замороженном состоянии, либо в виде лиофильно высушенного порошка.

2. Раствор субстрата. 8 мл 1 н. раствора едкого натра смешивают с 72 мл воды, затем добавляют 36 г мочевины (перекристаллизованной) и 10 мл 22% раствора гемоглобина (в пересчете на сухое вещество). Смесь выдерживают в течение 30-60 минут при 25° в термостате, после чего к ней добавляют раствор 4 г мочевины в 10 мл 1 мол раствора однозамещенного фосфата калия. Раствор субстрата хранят при 5°. Пригоден к употреблению в течение 7-10 дней.
3. Фенольный реактив. 100 г вольфрамата натрия и 25 г молиб-дата натрия растворяют в 700 мл воды. К раствору добавляют

50 мл концентрированной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно нагревают в течение 10 часов в колбе емкостью 1,5 л с обратным холодильником, после чего охлаждают и добавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель жидкого брома. Остаток брома отгоняют нагреванием смеси без холодильника (под тягой), охлаждают, доводят водой до 1 л и фильтруют. Реактив сохраняют в темноте. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора водой в отношении 1 : 2 перед употреблением.

Упаковка. Во флаконы или ампулы по 5 мг и 10 мг.

Хранение. В сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 10°.

Протеолитический фермент.

29.06.2015