ИЗОЛИРОВАНИЕ ПОДКИСЛЕННОЙ ВОДОЙ

 

 

Наиболее распространенным в практике судебно-медицинских лабораторий СССР является метод изолирования подкисленной водой.

Метод  изолирования   подкисленной   водой,   предложенный  Драгендорфом.

Одним из описанных в литературе методов изолировании, главным образом алкалоидов, является метод Драгендорфа. Идея изолирования подкисленной водой высказывалась и до него рядом авторов, например Грэмом.

По методу Драгендорфа алкалоиды и некоторые вещества неалкалоидного характера 2-3 раза извлекали при температуре 40-50° водой, содержащей серную кислоту. Водные вытяжки упаривали до сиропообразной консистен­ции, настаивали с 3-4-кратным объемом 96° спирта в течение 24 часов при температуре 30° и фильтровали. Фильтр с целью очистки обрабатывали пет-ролейным эфиром, а затем последовательно экстрагировали бензином, хлоро­формом и снова петролейным эфиром. После извлечений из кислого рас­твора водную жидкость подщелачивали раствором аммиака и снова после­довательно экстрагировали бензином и амиловым спиртом. Метод имел огра­ниченное применение, так как он обладал рядом недостатков, главным из которых являлись упаривание сернокислой вытяжки на водяной бане до сиро­пообразной консистенции и применение нескольких органических раствори­телей. Эти операции могли привести к значительным потерям ряда алка­лоидов.

Современная модификация метода извлечения подкисленной водой. В 1942 г. М. Д. Швайкова и А. В. Степанов для изолиро­вания алкалоидов из объектов растительного происхождения предложили так называемый скоростной метод извлечения алкалоидов. В 1947 г. этот метод был применен А. А. Васильевой с целью изолирования алкалоидов из свежих внутренних орга­нов трупа, а затем вошел в практику лабораторий страны.

В 1956-1961 гг. проф. В. Ф. Крамаренко и его сотрудники своими исследованиями показали необходимость учета рН среды как в процессе изолирования алкалоидов из биологического ма­териала, так и при экстрагировании их органическими раствори­телями из водных вытяжек (стр. 126). При учете этих данных исследование объектов растительного происхождения (мука, хлеб, крупа и т. д.) на наличие в них алкалоидов производится следующим образом: 5 г исследуемого объекта тщательно сме­шивают с 60 мл дистиллированной воды¹, подкисленной насы­щенным водным раствором винной (или щавелевой) кислоты до рН 2,0-2,5 (по универсальному индикатору), и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Периодически смесь взбалты­вают. Водный слой сливают декантацией и подвергают центри­фугированию 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Прозрачную жидкость переносят в делительную воронку и трижды новыми порциями (по 15-20 мл) осторожно, чтобы избежать образования эмульсии, экстрагируют хлороформом. Для разделе­ния эмульсии  (в случае ее образования) пользуются цептрифугированием. Хлороформную вытяжку исследуют на группу ве­ществ, экстрагируемых из кислого раствора, а также и некото­рые алкалоиды и вещества, обладающие слабо основными свой­ствами (кофеин, стрихнин, бруции).

Водный остаток подщелачивают раствором аммиака до рН 10 по универсальному индикатору и вновь 3-4 раза, соблюдая осторожность, экстрагируют небольшими порциями (по 15- 20 мл) хлороформа. Хлороформные извлечения, слитые вместе, по удалении хлороформа исследуют на наличие алкалоидов и других веществ основного характера (см. стр. 160).

При исследовании на наличие алкалоидов соли, сахара и т. п. задача значительно упрощается. Такие продукты растворяют в воде, подкисляют винной (щавелевой) кислотой до кислой реак­ции (рН 2-2,5) и повторно экстрагируют хлороформом из кис­лого раствора, а затем из раствора подщелоченного аммиаком до рН 10. Хлороформные вытяжки исследуют на наличие ве­ществ, экстрагируемых хлороформом из кислого и щелочного растворов.

При исследовании внутренних органов трупов (печень, желу­док и т. п.) на наличие алкалоидов и других органических ве­ществ поступают следующим образом: 100 г тщательно измель­ченного материала заливают 200 мл дистиллированной воды (со­отношение объекта и воды 1:2), подкисленной до рН 2,0-2,5 насыщенным водным раствором винной или щавелевой кислоты, и оставляют на 2 часа при периодическом взбалтывании. Водное извлечение сливают с твердых частиц объекта, а последние еще раз настаивают примерно час с водой, подкисленной винной или щавелевой кислотой до рН 2,5. Водную вытяжку процеживают через двойной слой марли. Объединенные извлечения центрифу­гируют. Прозрачную жидкость повторно экстрагируют хлоро­формом из кислого раствора (3-4 раза по 15-20 мл хлорофор­ма), а затем из щелочного (3-4 раза). Подщелачивание до рН 10 производят 25% раствором аммиака, проверяя реакцию среды по универсальному индикатору.

Соединенные вместе хлороформные вытяжки из кислого рас­твора исследуют на вещества, изолируемые из кислых растворов, а хлороформные вытяжки из щелочного раствора - на алкалои­ды и синтетические вещества основного характера.

Достоинства и недостатки метода изолирова­ния подкисленной водой. Метод изолирования алкалои­дов и других органических веществ, имеющих токсикологическое значение, подкисленной водой обладает рядом преимуществ пе­ред методом извлечения подкисленным спиртом. Наиболее важ­ные из них следующие.

• 1. Ускорение времени производства анализа в 3-4 раза.
• 2. Более высокая чувствительность по отношению к ряду ор­ганических веществ: стрихнину, бруцину, кониину, колхицину, дикаину, ареколину и другим соединениям. Повышение чувстви-

тельности в основном связано с меньшим количеством операций, возможно, и с отсутствием нагревания.

3. Метод не требует затраты чистого этилового спирта.

Недостаток метода заключается в трудности использования его для исследования на органические вещества, трудно раство­римые в воде, а иногда также при исследовании сильно загнив­шего трупного материала.

Частный метод изолирования подкисленной водой, предложен­ный В. Ф. Крамаренко. Исследованиями было показано влияние рН среды и природы кислоты на изолирование алкалоидов из объектов белкового происхождения водой, влияние рН среды и природы органического растворителя на экстрагирование неко­торых токсикологически важных алкалоидов из водных извлече­ний, влияние электролита на полноту экстрагирования.

Вопросу влияния рН среды на изолирование и экстрагирова­ние алкалоидов В. Ф. Крамаренко придает исключительно боль­шое значение. Несоблюдение оптимальных условий рН среды при извлечении алкалоидов водой из биологического материала животного происхождения является одной из причин значитель­ных потерь этих веществ в общем ходе химико-токсикологиче­ского анализа (табл. 3).

 

Алкалоиды, введенные в организм, подвергаются различным превращениям: гидролизу, окислению, восстановлению и т. п.; только немногие алкалоиды выделяются из организма в неиз­мененном виде. Одним из свойств алкалоидов является способ­ность их вступать во взаимодействие с молекулой белка и обра­зовывать комплексы, не изолируемые или трудно изолируемые водой. Реакция взаимодействия алкалоидов с белками протекает обычно при величине рН, лежащей выше изоэлектрической точки белков  (рН 4-5), т. е. в слабокислой области. С повышением

 

 

рН возможность связывания алкалоидов белками увеличивается, а это значит, что комплексообразование между алкалоидами и белками возможно и в живом организме (рН крови 7,3-7,5) и в трупе (рН 6,2 и выше). Для того чтобы изолировать алкалои­ды из биологического материала, необходимо прежде всего раз­рушить комплексы алкалоидов с белками. Разрушение этих комплексов происходит в результате изменения рН среды. По данным В. Ф. Крамаренко, оптимальным является рН 2,5- 3,0¹. Алкалоиды, освобожденные из комплексных соединений с белками при подкислении объекта до рН 2,5-3,0, экстрагируют из водных растворов органическими растворителями. В зависи­мости от константы диссоциации алкалоиды переходят из солей в свободные основания при различных значениях рН среды. Сла­боосновные алкалоиды, например кофеин (К = 4,1 • 10^-14), соли которых полностью гидролизуются в водных растворах, экстра­гируются из водных растворов органическими растворителями даже из кислой среды. Более сильные основания, например па­паверин (К = 8,15-10~⁹) или наркотин (К= 1,5-10~⁸), переходят в основания и экстрагируются из слабощелочной среды и, нако­нец, алкалоиды со сравнительно большой величиной константы диссоциации, например кодеин (К = 9-10^TM7), требуют для своего извлечения более сильного подщелачивашш. Степень экстрагиро­вания алкалоидов различными органическими растворителями представлена в табл. 4.

Из приведенных в табл. 4 данных видно, что лучшими органическими растворителями для большинства изученных ал­калоидов являются изоамиловый спирт и хлороформ, а для алкалоидов группы тропана -и дихлорэтан. Область экстрагиро­вания алкалоидов довольно широка -от рН 2 до рН 6, рН 7 и выше. Оптимальные условия для экстрагирования большинства алкалоидов создаются при рН 10, однако все эти алкалоиды в определенной степени экстрагируются и из кислых растворов. Лучшими растворителями для экстрагирования алкалоидов яв­ляются изоамиловый спирт (неудобей в работе из-за высокой температуры кипения и токсичности) и хлороформ; для отдель­ных алкалоидов (см. табл. 4) удобен дихлорэтан. Худшими рас­творителями для всех алкалоидов являются бензол и эфир. По отношению к бензолу исключение составляют кокаин и плати-

филин.

На степень извлечения алкалоидов органическими раствори­телями из водных растворов определенное влияние оказывают электролиты. С увеличением концентрации электролитов в вод­ных растворах степень экстракции алкалоидов органическими растворителями повышается. Из кислых водных растворов, на­сыщенных NaCl или (NH₄)₂SО₄, алкалоиды экстрагируются луч­ше, чем из растворов, не содержащих этих электролитов, причем характер кислоты оказывает влияние на процесс экстрагирова­ния алкалоидов: в случае подкисления щавелевой и соляной кис­лотами алкалоиды лучше экстрагируются из водных растворов, чем при подкислении серной кислотой.

Методика        изолирования        алкалоидов,        разработанная
В. Ф. Крамаренко, сводится к следующему: тщательно измель­
ченный биологический  материал  заливают в  колбе  разбавлен­
ным    раствором    серной    кислоты до покрытия твердых частей
объекта,    хорошо   перемешивают и с помощью серной кислоты
доводят    рН   до   2,5.    Через 2 часа убеждаются в сохранении
рН 2,5 и твердые части объекта отделяют процеживанием через
марлю. Операцию извлечения  повторяют 2-3 раза, настаивая
по 1-2 часа с водой, подкисленной серной кислотой до рН 2,5.
Все порции отцеженной жидкости соединяют вместе и подвер­
гают центрифугированию (при фильтровании наблюдаются зна­
чительные потери алкалоидов за счет сорбции их фильтроваль­
ной бумагой).  Центрифугат осторожно  сливают  с  осадка   и  к
жидкости добавляют (NH₄)₂SО₄ до насыщения  (рН 2,5 должно
сохраниться). Образовавшийся осадок отделяют центрифугиро­
ванием. Кислую вытяжку 1-2 раза взбалтывают с 50 мл эфира
Эфирный слой отделяют, а к кислой водной вытяжке осторожно
небольшими порциями добавляют водный раствор едкого натра
до рН 8,5-9,0 [при взаимодействии   (NH₄)₂SО₄ и NaOH обра­
зуется NH₄OH]. Подщелоченную вытяжку 4 раза (по 7з объема
от   водной   фазы)    экстрагируют хлороформом. Хлороформные
вытяжки соединяют вместе и хлороформ отгоняют на  водяной
оане. Сухой остаток растворяют в нескольких миллилитрах хло­
роформа и отдельные порции хлороформного раствора исследу­
ют на наличие алкалоидов (см. стр. 160).

Оценка рекомендованного метода (В. Ф. Крамаренко) в срав­
нении с методом изолирования подкисленным спиртом  (Стаса             

Отто) и подкисленной водой (в первоначальной модификации), сделанная Крамаренко, характеризует метод положительно по отношению к ряду алкалоидов (см. табл. 4).

Кроме описанных методов изолирования алкалоидов, при хи­мико-токсикологических исследованиях иногда для отдельных алкалоидов (ареколин, никотин, кониин) рекомендуется дистил­ляция с водяным паром с последующим экстрагированием алка­лоида из дистиллята соответствующим органическим раствори­телем.

Все описанные методы изолирования алкалоидов не гаранти­руют, однако, получения настолько чистого вещества, чтобы оно могло быть обнаружено и определено в дальнейшем обычными аналитическими реакциями и методами. Как правило, алкалоид или другое вещество основного характера, представляющее ток­сикологический интерес, изолируется из объектов исследования вместе с жирами, жирными кислотами, белками и продуктами их распада (смолы, красящие вещества и т. п.), маскирующими это вещество и мешающими его обнаружению и определению. Особое значение при этом приобретает очистка изолированных из биологического материала   (трупный материал)   алкалоидов.

Коллектив кафедры токсикологической и аналитической химии Львовского медицинского института успешно продолжает свои исследования по изучению условий изолирования и экстрагиро­вания алкалоидов (анабазин и никотин, ареколин, тебаин, нар­котин, нарцеин, пилокарпин и др.) и барбитуратов.

 

Так, работами В. И. Поповой с соавторами показано значение рН среды и природы органического растворителя, а также влия­ние электролита на экстракцию барбитуратов. Из приведенных в табл. 5 данных видно, что лучшим  растворителем  является эфир па втором месте стоят хлороформ и дихлорэтан (барбитал в этом отношении составляет исключение). Максимум экстрак­ции барбитуратов лежит в кислой области.

Показано также, что влияние электролитов на экстракцию за­висит и от природы электролита, и от его количества: при вве­дении    больших   количеств электролитов (50% или даже 25/о) барбитураты выпадают в осадок.

Основные положения, выдвинутые В. Ф. Крамаренко с сотруд­никами в результате детального изучения метода изолирования подкисленной водой, такие, как учет рН среды при изолирова­нии и при экстрагировании алкалоидов, замена фильтрования центрифугированием, роль сульфата аммония, природа органи­ческою растворителя, большинством химиков судебно-медицин­ских лабораторий нашей страны приняты и модификации мето­да находят практическое применение.

29.06.2015