Общие вопросы изолирования, обнаружения и определения алкалоидов

 

 

Под алкалоидами понимают большую группу азотсодержа­щих органических оснований сложного состава, встречающихся в растительных (реже в животных) организмах и обладающих, как правило, сильным фармакологическим действием. Алкалои­ды с каждым годом приобретают все большее значение в каче­стве ценных лекарственных препаратов. Некоторые алкалоиды применяются как инсектофунгициды. Научное значение алка­лоидов заключается в выяснении их роли в жизни и развитии растений, выявлении новых направлений в синтезе фармацевти­ческих препаратов.

Как лекарственные препараты алкалоиды проявляют физио­логический эффект часто уже в чрезвычайно малых количест­вах, в связи с чем многие из них при определенных условиях яв­ляются ядовитыми или сильнодействующими веществами, а сле­довательно, представляют большой токсикологический интерес. Как главные действующие вещества многих видов и семейств растений алкалоиды сравнительно легко доступны. При поеда­нии частей растений, содержащих алкалоиды, детьми или до­машними животными они нередко являются причиной отравле­ния, часто заканчивающегося смертельным исходом.

Отравления отдельными алкалоидами сопровождаются харак­терными симптомами, например, тетаническими судорогами при отравлении стрихнином, расширением зрачков глаз при отравле­ниях алкалоидами группы тропана. Однако патологоанатомиче­ские изменения при отравлениях, как правило, являются невы­раженными. Поэтому по одним только результатам судебно-ме­дицинского исследования трупа человека (или животного), по­гибшего от отравления алкалоидами, чрезвычайно редко удается прийти к правильному заключению об отравлении. Химико-ток-

синологическое исследование в этих случаях приобретает особо важное значение.

Если причиной отравления явились части растений, то необ­ходимо произвести судебно-фармакогностическое исследование. Ценные данные могут быть получены» например, при обнаруже­нии волосков семян чилибухи, при исследовании семян белла­донны, клубней аконита и т. п.

Химико-токсикологическое исследование биологического мате­риала на наличие алкалоидов относится к числу сложных и тру­доемких, связанных с производством ряда сложных операций, главными из которых являются следующие:

• 1) возможно полное извлечение алкалоида из объекта иссле­дования. Самым трудным объектом исследования являются внут­ренние органы трупа (биологический материал животного про­исхождения). Извлечение алкалоидов из объекта исследования, как правило, включает две операции: изолирование алкалоидов из биологического материала и экстрагирование органическим растворителем из водной вытяжки;
• 2) очистка остатка хлороформного извлечения из щелочного раствора;
• 3) исследование остатка «общеалкалоидными осадительными реактивами»; преимущественно с целью исключения наличия алкалоидов;

4)      исследование химическими реакциями для установления
наличия алкалоидов;

• 5) подтверждение результатов химического исследования фар­макологическими опытами, что необходимо для окончательного доказательства некоторых алкалоидов;
• 6) количественное определение алкалоидов (в тех случаях, где это возможно).

Подавляющее большинство алкалоидов в виде оснований при обыкновенной температуре представляет собой кристаллические, реже аморфные твердые вещества. Основания кониина, ареколи-на, никотина, анабазина, пахикарпина являются жидкостями.

Большинство оснований алкалоидов труднорастворимы или нерастворимы в воде и растворимы в органических растворите­лях: этиловом спирте, эфире, хлороформе, амиловом спирте и др. Однако жидкие алкалоиды в отличие от большинства соеди­нений этого класса хорошо растворяются в воде даже в виде оснований. Это свойство надо учитывать при проведении хими­ко-токсикологического анализа, особенно когда поставлено спе­циальное задание произвести исследование на наличие опреде­ленного алкалоида.

Водные растворы оснований алкалоидов, за очень редким ис­ключением, обладают щелочной реакцией на лакмус и другие индикаторы, интервал изменения окраски которых лежит при рН около 7,0. Атропин и кодеин имеют щелочную реакцию на фенолфталеин.

Основной характер алкалоидов характеризуется константой диссоциации (табл. 8), которая имеет тем большую величину чем сильнее основные свойства алкалоидов.

 

Константа диссоциации алкалоидов колеблется в очень широ­ких пределах - от 10^-2 до 10^-14, При наличии в молекуле алка­лоида двух атомов азота основного (аминного) характера вто­рая константа диссоциации обычно много меньше первой.

Взаимодействуя с кислотами, алкалоиды образуют соли по типу солей аммиака или аминов. Соли алкалоидов, особенно кислые с минеральными (серная, соляная, фосфорная) или орга­ническими   (виннокаменная,  щавелевая,  лимонная)   кислотами,

за редкими исключениями, легко растворяются в воде, а иногда и в спиртах (этиловом и метиловом), но в большинстве случаев нерастворимы в эфире, углеводородах, некоторых галогенопро­изводных углеводородов.

Хлористоводородные соли кокаина, нарцеина, наркотина, па­паверина, тсбаипа растворяются в хлороформе, поэтому в про­цессе извлечения они могут оказаться частично извлеченными из кислого раствора (вместо щелочного), что нельзя забывать при производстве химико-токсикологического анализа. То же от­носится к бромистоводородным солям скополамина и хинина. В противоположность этому основания некоторых из алкалоидов не растворяются в общеупотребительных растворителях, напри­мер морфии в эфире, - свойство, установленное еще более 100 лет назад (Ю. Отто и Р. Отто).

Растворимость некоторых солей алкалоидов в спиртах также должна учитываться, так как продажный хлороформ может со­держать следы спирта. Прочных солей, особенно в водных рас­творах, могут не образовывать алкалоиды с малой величиной константы диссоциации (у кофеина 4,1•10^-14). Некоторые из та­ких алкалоидов образуют соли, но последние быстро гидролизу-ются. При извлечении органическим растворителем из кислого раствора эти алкалоиды-основания (после гидролиза солей) пе­реходят из водного раствора, особенно при недостаточном под-кислении, в органический растворитель. Так ведут себя кофеин и теобромин, всегда обнаруживаемые при химико-токсикологиче­ском анализе в кислой хлороформной или эфирной вытяжке, наркотин, папаверин, колхицин, вератрин, отчасти стрихнин и бруцин.

Б. И, Швыдкий с соавтор, и 3. С. Рокач показали, что папа­верин, тебаин и наркотин начинают экстрагироваться органиче­скими растворителями уже при рН 1,6, 1,7 и 1,0 (соответствен­но) в количествах при экстракции хлороформом до 59% для па­паверина, 8-10% -для тебаина. Максимум экстракции хлоро­формом, однако, лежит в области рН 4,0-6,0 (73-79%) для папаверина, 8-11,6 (96-98%) для тебаина и 4,0-7,0 для нар­котина. Так как вторая константа диссоциации много меньше первой, то при присоединении второго эквивалента кислоты, как правило, образуются непрочные, легко гидролизующиеся соли. Поэтому такие алкалоиды, как стрихнин, дают соли только с од­ной молекулой кислоты.

Щелочи (NaOH, КОН, Са(ОН)₂, NH₄OH и даже Na₂CО₃) раз­лагают соли алкалоидов как производные слабых оснований с выделением свободных оснований, которые извлекаются затем органическим растворителем.

Алкалоиды, содержащие в своем составе фенольный гидрок­сил (морфин, сальсолин), со щелочами образуют феноляты, рас­творимые в воде и не извлекаемые органическими растворителя­ми, что используется в аналитической практике, например для разделения морфина, содержащего свободный фенольный гидр­оксил, и кодеина друг от друга.

Алкалоиды, являющиеся по своей природе сложными эфира­ми (атропин, кокаин, ареколин и др.), от действия щелочей мо­гут омыляться, а потому в процессе изолирования требуют со­здания определенных «мягких» условий.

Все эти свойства алкалоидов имеют очень большое значение для аналитической и особенно химико-токсикологической прак­тики.

Очистка хлороформного извлечения. Хлороформное извлече­ние из щелочного раствора часто бывает загрязнено жиром, про­дуктами распада белков, красящими, дубильными и другими ве­ществами. Поэтому в случаях, когда остаток, полученный испа­рением хлороформа из щелочной хлороформной вытяжки, боль­шой по объему, маслянистый и окрашен в буроватый или бурый цвет, его необходимо подвергнуть очистке. Однако очистку сле­дует производить чрезвычайно осторожно, так как каждая лиш­няя операция, например извлечение или фильтрование, ведет к потере части вещества.

Из возможных методов очистки (экстракция, осажде­ние, адсорбция, диализ и электродиализ, элек­трофорез, хроматография) наиболее перспек­тивным методом является хроматография, в частности хроматография в тонком слое. Чаще всего хроматография в тонком слое в целях очистки сочетается  с экстракцией.

Применению хроматографии в тонком слое в различных целях, в том числе в анализе лекарств и в химико-токсикологическом анализе, посвящена большая литература.

Отечественные эксперты-химики успешно использовали хрома­тографию в тонком слое в анализе алкалоидов анабазиса (Е. А. Грязнова), секуринина и стрихнина (К. П. Лапина), эфед­рина (А. И. Шаев), алкалоидов группы тропана и эргоалкалои­дов (Г. Ф. Лозовая), прозерина (В. В. Зимнухов), хингамина (А. И. Буракова), промедола, декаметония (В. А. Кудимова), аминазина и имизина, гликозидов, барбитуратов, ноксирона и других веществ.

Полученный после испарения хлороформа остаток обрабаты­вают 3-5 мл дистиллированной воды, подкисленной 1% рас­твором виннокаменной кислоты до ясно кислой реакции по лак­мусу, и тщательно отделяют от поверхности чашки с помощью оплавленной стеклянной палочки. Раствор фильтруют через ма­ленький складчатый фильтр, смоченный водой. Фильтр промы­вают 2-3 мл дистиллированной воды, присоединяя промывные воды к первоначально полученной жидкости.

Жидкость экстрагируют 3-4 раза небольшими порциями (по 3-5 мл) хлороформа сначала из кислого раствора, а затем из раствора,   подщелочного    (по   фенолфталеину)  10% раствором аммиака. Хлороформные вытяжки из щелочного раствора соеди­няют вместе, фильтруют через маленький сухой складчатый фильтр, смоченный хлороформом, собирая фильтрат в чашку Петри. Хлороформ испаряют при комнатной температуре, а остаток подвергают соответствующему исследованию. Если оста­ток по удалении хлороформа снова будет обильным и загрязнен­ным, что наблюдается при исследовании сильно загнившего ма­териала, проводят повторную очистку экстракцией или с приме­нением хроматографии в тонком слое, что связано с задачей, поставленной перед экспертом-химиком.

Очистка остатка, исследуемого на алкалоиды, после их изолирования по методу В. Ф. Крамарен­к о. На основании данных литературы и собственных исследо­ваний В. Ф. Крамаренко рекомендует для очистки применять «высаливание» белков и продуктов их распада безводным суль­фатом аммония, центрифугирование и экстрагирование этило­вым эфиром веществ, сопровождающих алкалоиды. Методика очистки описана на стр. 129. Этим способом очистки устраняются процессы фильтрования, приводящего к потере алкалоидов за счет адсорбции фильтром и образования стойких эмульсий. По­тери алкалоидов при этом способе очистки, по данным В. Ф. Крамаренко, не превышают 1-3%.

В последние годы при получении алкалоидов из расти­тельного сырья начали применять метод адсорбции углем и ионообменными сорбентами. В качестве последних используют глины или искусственные смолы. Водные вытяжки или кислые диффузионные соки для этой цели механически перемешивают с сорбентом или пропускают через колонку с ионообменными смолами. Десорбцию алкалоидов производят обработкой сорба-та сначала водным раствором щелочи, а затем органическим растворителем.

В токсикологической химии метод сорбции пока не получил применения ни в нашей стране, ни за рубежом, несмотря на его перспективность.

Как метод очистки может рассматриваться электродиализ и электрофорез, применяющиеся до сих пор ограниченно в прак­тике химико-токсикологического анализа.

Перспективным методом очистки, разделения и предваритель­ной идентификации является хроматография в тонком слое.

Исследование общеалкалоидными (осадительными) реактива­ми. Остаток, полученный после удаления хлороформа из щелоч­ной хлороформной вытяжки, или остаток, полученный после очистки, испытывают прежде всего по отношению к общеалкало­идным осадительным реактивам.

Применение этих реактивов основано на свойстве алкалоидов как оснований давать даже в разбавленных растворах простые или комплексные соли с кислотами, солями тяжелых металлов, комплексными йодидами и другими веществами.

В зависимости от свойств алкалоидов различные соли их, как простые, так и комплексные, обладают различной раствори­мостью в воде, поэтому в аналитической химии применяется то один, так называемый общеалкалоидный реактив, то другой. Отсюда ясно, почему в литературе описано большое количест­во осадительных алкалоидных реактивов. В 1932 г. Фултон при­водит 91 реактив, способный давать осадки с алкалоидами и тем самым рассматриваемый как «общеалкалоидные реактивы», а в 1940 г. этот же автор использовал еще 93 реагента. Количество этих реактивов ежегодно увеличивается.

Общие реактивы, осаждающие алкалоиды, можно разделить на две большие группы: 1) реактивы, дающиесалкалои­дами простые соли: дубильная (танин), пикриновая, пик­ролоновая и реже применяемые - хромовая, марганцовая, ро­данистоводородная и другие кислоты; 2) реактивы, даю­щие с алкалоидами комплексные соли, которые в свою очередь подразделяются еще на две подгруппы: а) реакти­вы, содержащие в своем составе металлоиды I₂/KI; Вr₂/КВг; IC1 фосфорно-молибденовая, фосфорно-вольфра­мовая, кремневольфрамовая и другие кислоты; б) реактивы, содержащие в своем составе металлы: CdI₂/KI; HgI₂/KI; BiI3/KI; ZnI₂/KI; HgCl₂; НАuСl₄; H₂PtCl₆; K₃[Fe(CN)₆]; K2[Pt(CN)₄]; K[Ag(CN)₂] и др. В практике химико-токсиколо­гического анализа применение получили лишь немногие из опи­санных в литературе общеалкалоидных осадительных реактивов.

Танин. Используется свежеприготовленный раствор 1:10 или 1:100. Танин образует с солями алкалоидов как в нейтральной, так и в слабо­кислой среде белые или желтоватые осадки, разлагаемые щелочами с образо­ванием оснований алкалоидов. Осадки растворимы в спирте, уксусной кис­лоте и солях аммония.

Пикриновая кислота. Насыщенный раствор (приблизительно 1 %) дает почти со всеми алкалоидами, кроме аконитина, кофеина, теобромина, кониина и морфина пинкраты, выпадающие в осадок. Многие пикраты имеют кристаллическое строение и определенную температуру плавления.

Раствор йода в йодиде калия. Растворяют 1 г йода в растворе 2 г йодида калия в 50 мл воды (реактив Вагнера) или 1,27 г йода и 2 г йодида калия в 100 мл воды (реактив Бушарда). Реактивы дают с водны­ми растворами солей алкалоидов бурые осадки гидройодндов АlК • _НI•Iх.

Раствор йодида висмута в йодиде калия BiI₃/KI ил» KBiI₄ (реактив Драгендорфа). Растворяют 8 г основного нитрата висмута в 20 мл азотной кислоты удельного веса 1,18 и вливают в раствор, содержа­щий 27,2 г йодида калия в 30 мл воды. Через несколько дней жидкость от­фильтровывают от выделившегося нитрата калия, а фильтрат разбавляют водой до 100 мл. Раствор йодида висмута в йодиде калия образует с раство­рами сернокислотных и солянокислых солей алкалоидов аморфные, а с нико­тином, анабазином, кониином, ареколином, пахикарпииом, эфедрином - кри­сталлические осадки оранжевого или кирпично-краспого цвета.

Раствор йодида кадмия в йодиде калия CdI₂/KI ил» K₂CdI₄ (реактив Марме). Растворяют 5 г йодида кадмия в горячем рас­творе, содержащем 10 г йодида калия в 30 мл воды, и затем смешивают с равным объемом насыщенного раствора йодида калия. Реактив образует с алкалоидами белые или желтоватые осадки, как правило, растворимые в избытке реактива; некоторые алкалоиды (атропин) осаждаются лишь из срав­нительно концентрированных растворов; кофеин не осаждается.

Раствор йодида ртути в йодиде калия HgI₂/KI или K₂HgI₄ (реактив Манера). 1,35 г хлорида ртути HgCl₂ обрабатывают концентриро­ванным раствором, содержащим 5 г йодида калия, и разбавляют водой до 100 мл. В слабокислых пли нейтральных растворах реактив образует белые или желтоватые осадки общей формулы A1K•HI•(Hgl₂)_n. He образуются осад­ки с колхицином и кофеином.

Фосфорно-молибденовая кислота Н₃РO₄ • 12МоО₃•2Н₂О (реак­тив Зонненшейеа). Раствор моногидрофосфата натрия Na₂HPО₄ осаждают раствором молибдата аммония в азотной кислоте. Осадок растворяют в воз­можно малом количестве раствора карбоната натрия. Раствор выпаривают досуха, остаток прокаливают до полного удаления аммиака, затем раство­ряют в десятикратном количестве воды и прибавляют азотную кислоту до тех пор, пока вначале образовавшийся осадок снова не растворится. Фос-форно-молибденовая кислота является одним из наиболее чувствительных реактивов на алкалоиды. Она образует аморфные или кристаллические светло-желтые и бурые осадки, из которых едкие и углекислые щелочи вы­деляют основания алкалоидов. Многие алкалоиды очень чувствительны к этому реактиву.

Фосфорно-в ольфрамовая кислота Н₃РО₄ • 12WO₃• 2H₂O (реак­тив Шейблера). 10 г вольфрамата натрия и 7 г моногидрофосфата натрия Na₂HPО₄ растворяют в 50 мл воды и подкисляют азотной кислотой. Реак­тив образует белые аморфные осадки почти со всеми алкалоидами. Осадки разлагаются гидратом окиси бария или гидратом окиси кальция с выделе­нием свободных алкалоидов. Многие алкалоиды очень чувствительны к этому реактиву.

Платинохлористоводородная кислота Н₂РtСl₆. Раствор 1: 20. Со многими алкалоидами дает аморфные, а с некоторыми (героин) - характерные кристаллические осадки.

Чувствительность осадительных реактивов неодинакова по от­ношению к различным алкалоидам. На первом месте по чувст­вительности стоит фосфорно-вольфрамовая кислота, затем фос-форно-молибденовая кислота, растворы йодида висмута в йодиде калия, йода в йодиде калия и др. Наименее чувстви­тельными реактивами являются танин и пикриновая кислота (табл. 9).

Ввиду различной чувствительности общеалкалоидных осади­тельных реактивов, естественно, при чрезвычайно ответственном анализе, каковым является химико-токсикологический анализ, нельзя удовлетвориться применением лишь одного реактива. Может оказаться, что этот реактив будет нечувствителен к не­известному алкалоиду, содержащемуся в объекте исследования в виде ничтожных следов. В то же время применение большого количества реактивов из числа известных нерационально, так как приведет к бесцельному расходованию чрезвычайно ценного для анализа материала.

Все общеалкалоидные реактивы не являются специфичными для алкалоидов. Кроме алкалоидов, трудиорастворимые осадки или образование мути способны давать белки, продукты их рас­пада, другие вещества, содержащие гетероатом азота (напри­мер, отдельные лекарственные препараты). В силу этого реак­ции    с    общеалкалоидными    реактивами рассматриваются как

 

 

 

предварительные исследования, способные лишь определенным образом ориентировать химика.

В химико-токсикологическом анализе для достижения макси­мальной уверенности в направлении анализа по правильному пути применяют обычно не один, а 3-4 наиболее чувствитель­ных, характерных и доступных осадительных общеалкалоидных реактива.

В судебно-медицинских лабораториях СССР наиболее часто применяются следующие реактивы: раствор йода в йодиде ка­лия, йодида висмута в йодиде калия, йодида ртути в йодиде ка­лия,   фосфорно-молибденовую    (или   фосфорно-вольфрамовую)

кислоту.

Техника проведения реакций. Остаток после испаре­ния хлороформа из щелочного извлечения растворяют в 1-2 мл хлороформа и по одной капле полученного раствора помещают на 3-4 часовых или предметных стекла. После испарения хло­роформа остатки тщательно растворяют в 1-2 каплях 0,01 н. раствора соляной кислоты. К полученным растворам осторожно подводят по одной капле реактива и наблюдают образование либо осадка, либо мути в месте соприкосновения двух капель, а при больших количествах алкалоида выделения осадка во всем объеме капли. Наблюдение производят на темном фоне.

Правильная оценка результатов реакций осаждения алкалоидов общеалкалоидными реактива­ми имеет очень большое значение. Если учесть, что реакции эти неспецифичны и чувствительность их колеблется в самых широ­ких пределах, станет ясным, что получение мути или осадка при использовании 3-4 общеалкалоидных реактивов будет показы­вать наличие в исследуемом материале какого-то азотсодержа­щего вещества основного характера (не обязательно алкалои­да). Установить, что это за вещество можно только после при­менения других реакций и способов исследования. Получение положительных реакций с общеалкалоидиыми реактивами по­этому не служит поводом для заключения о наличии в объ­екте исследования алкалоидов. Наоборот, отрица­тельный результат реакций с общеалкалоидными реактивами - отсутствие мути или осадка - дает право делать вывод о том, что при проведенном определенным способом исследовании не •найдено алкалоидов и каких-либо других веществ, которые мог­ли бы дать осадки или образовать муть с осадительными реак­тивами. Принято считать, что реакции с общеалкалоидными ре­активами имеют в токсикологической химии только отрица­тельное значение. Это значит, что только при отрицатель­ных результатах этих реакций можно сделать вывод о ненахож­дении алкалоидов. Получение же положительных результатов может расцениваться всего лишь как необходимость дальнейше­го терпеливого и настойчивого исследования на наличие алка­лоидов другими реакциями.

 

 

 

 

29.06.2015